西安中华脐血造血干细胞库的建立及其应用研究

陕西医大血液病研究院

一、立项依据
（ 一）概念 脐血干细胞库（Cord Blood Stem Cell Bank）,简称脐血库（BSCB），亦称生命银行（Life Bank），生命保险（Life insurance）。是将婴儿与胎盘脐带分离后，采集胎盘与脐带血，通过现代科学技术，分离出其中的干细胞，程控降温，深低温保存，以备孩子本人、亲属及整个人类生命急需时应用的一种高科技生命科学机构，是当今最前沿的生命科学，是一个地区高科技生命科学的标志。
（二）研究的进展 19世纪30年代，俄、英、法等国家已建立了类同一般血库的经典脐血库，并倡导临床输用脐血。1988年首先采用HLA相合的同胞脐血移植治疗范康尼贫血获得成功，欧美科学家开始意识到建立现代脐血库的重要性和必要性。1993年美国纽约Rubinstein等创建了第一个现代脐血库，并对2例急性淋巴细胞白血病患儿进行了脐血移植。至1999年7月全世界已完成1100例儿童及成人脐血移植。由于政府及全社会已认识到建立现代脐血库的必要性、重要性和紧迫性，政府、社会团体、慈善机构、基金会、大企业财团、私人等各阶层积极参与，美国各州均已建立了脐血库。英、法、德、意、澳、日、比利时、西班牙、荷兰、加拿大等国家也建立了现代脐血库，现有250多个，保存脐血21000份以上，并成立了国际脐血网。
随着世界脐血应用研究的进展，我国各界人士已认识到脐血库建立的重要意义及紧迫性。北京、天津、上海、山东、广州、四川、河南等相继建立了脐血库。1998年卫生部组织专家讨论，1999年颂发了我国脐血库建立与发展规划。2003年中华脐血网建立，为中国脐血库的建立及应用奠定了基础。
（三）用途及研究意义 干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的原始细胞，既是人体的起源细胞，形成人体组织器官的种子细胞，也是基因治疗的载体细胞。其用途：
1、重建血液和免疫系统：（1）脐血输注治疗再障贫血、骨髓增生异常综合症等；（2）以排斥反应轻，造血功能恢复快为特点，可替代骨髓移植，进行脐血移植，治疗急性白血病、急性再生障碍性贫血、慢粒白血病、非何杰金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、骨髓纤维化、范孔尼综合症、Blackfan-Diamond综合症、镰状细胞贫血、PNH综合症、地中海贫血、免疫缺陷病、遗传代谢缺陷病、恶性肿瘤（小细胞未分化肺癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、睾丸癌、肉瘤）等。
2、修复衰老或病变的组织器官：更重大的意义在于干细胞在特定条件下，经诱导可跨系统分化为人体各种类型的细胞、组织和器官，如红细胞、白细胞、血小板、肌肉、神经、血管内皮、软骨、角膜、皮肤等细胞，用于修复、更新损伤、病变、衰老的人体组织和器官，治疗血液病、肿瘤、心血管病（心肌梗塞）、神经损伤、角膜损伤、糖尿病、肝病（对急性肝萎缩、肝坏死特别有效）、肾病、烧伤、老年病、免疫缺陷病等40多种疾病，对改变生存状态，延长生命具有很多目前难以估量的重大意义和用途。
因此，保存脐血干细胞就等于为孩子、亲属和人类保存生命，这就是生命银行和生命保险的来源、重大意义和立项依据。
二、研究方案
（一）研究内容
1、研究脐血的采集与适应的选择，脐血干细胞的分离、保存、复苏、临床应用等（由研究院承担）。2、干细胞的基础应用、基因工程产品、脐血移植等（由交大、军大、小医院等完成）。
（二）脐血库拟采取的研究方法和技术路线，按照美国纽约Rubinstein脐血库规范标准操作及质控指标进行。
1、脐血的采集：在知情同意的原则下，产妇应妊娠＞35周，无传染病（乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、巨细胞病毒、EB病毒）、遗传病及妇科并发症（胎盘发育不良、胎般钙化、脐带血管畸形、难产及胎儿不适宜）等。
在第3产程，断脐后，在无茵操作下，通过脐静脉，封闭式二联袋法（CPD-A抗凝）采集脐血，4℃贮存，＜24小时处理。
2、干细胞分离和保存：给脐血中加入1/4体积的6%羟乙基淀粉，混匀，10℃低温倒置，600r/min，去除下层红细胞，再正置离心（100r/min）10min，去除上层血浆，收集底部富含有核细胞及干/祖细胞，终体积约48ml，加入DMSO，使其终浓度为10%，混匀，-80℃冰箱放置2h，或通过自动程控降温装置，以1℃/min速率降温至-80℃，然后放入液氮中冷冻保存。
3、脐血干细胞复苏：将脐血自液氮中取出，迅速放入38℃恒温水浴箱中快速复温，溶化使用。
4、质量检测
（1）HLA分型AB位点分型：新鲜脐血标本，采用血清学方法；DR位点采用低分辨率PCR-SSP方法鉴定。
（2）ABO血型检测 采用聚凝胺法。
（3）病原体微生物检测 ①HBsAg、抗-HCV、EB、IgA、CMV-IgM检测：用ELISA法；②需氧茵和厌氧茵检测；用硫乙醇酸盐培养基；③真茵及腐生茵检测：用改良马丁培养基，分别置30~35℃和20~25℃培养箱中培养14d，无茵生长者合格。
（4）细胞活力检测 采用苔盼兰试验。
（5）CD34+细胞检测 采用CD45-FITC、CD34-PE同时标记脐血有核细胞，设计CD45-FITC、IgGI-PE对照，通过流式细胞仪（FCM）检测。
（6）CFU-GM检测 用甲基纤维素法CO2箱中培养，培养体系中含0.9%甲基纤维素、30%胎牛血清、10-4moI/LrhSCF等细胞因子。
（7）有核细胞计数（TNC） 显微镜计数。
（三）预期目标 按照Rubinstein标准衡量，保存20~40年，脐血干细胞数量和质量合格，无病原体微生物污染；TNC计数＞0.9×109，经HES分离有核细胞回收率＞90%，细胞活力＞90%。
三、研究基础
（一）原有基础 刘陕西教授、博士生导师于1986~1987年在
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